قۇرتقا قارشى دورا N,N-دىئېتىل-m-تولۇئامىد (DEET) نىڭ AChE (ئاتسېتىلخولىنستېرازا) نى چەكلەيدىغانلىقى ۋە قان تومۇرلارنىڭ ھەددىدىن زىيادە كېڭىيىشى سەۋەبىدىن راك پەيدا قىلىش خۇسۇسىيىتىگە ئىگە ئىكەنلىكى خەۋەر قىلىنغان. بۇ ماقالىدە، بىز DEET نىڭ ئانگىئوگېنېزنى ئىلگىرى سۈرىدىغان ئېندوتېلىي ھۈجەيرىلىرىنى ئالاھىدە قوزغىتىپ، شۇ ئارقىلىق ئۆسمە ئۆسۈشىنى ئاشۇرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىمىز. DEET ئانگىئوگېنېزغا ئېلىپ بارىدىغان ھۈجەيرە جەريانلىرىنى، شۇ جۈملىدىن كۆپىيىش، كۆچۈش ۋە چاپلىشىشنى ئاكتىپلاشتۇرىدۇ. بۇ ئېندوتېلىي ھۈجەيرىلىرىدە NO ئىشلەپچىقىرىش ۋە VEGF ئىپادىسىنىڭ ئېشىشى بىلەن مۇناسىۋەتلىك. M3 نى جىمجىتلاش ياكى فارماكولوگىيىلىك M3 چەكلىگۈچىلىرىنى ئىشلىتىش بۇ تەسىرلەرنىڭ ھەممىسىنى يوقىتىپ، DEET قوزغىغان ئانگىئوگېنېزنىڭ M3 غا سەزگۈر ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. ئېندوتېلىي ۋە HEK ھۈجەيرىلىرىدە كالتسىي سىگنالىنىڭ M3 رېتسېپتورلىرىنى ھەددىدىن زىيادە ئىپادىلىشىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان تەجرىبىلەر، شۇنداقلا باغلىنىش ۋە تۇتاشتۇرۇش تەتقىقاتلىرى DEET نىڭ M3 رېتسېپتورلىرىنىڭ ئاللوستېرىك مودۇلياتورى سۈپىتىدە رول ئوينايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. ئۇنىڭدىن باشقا، DEET AChE نى چەكلەيدۇ، شۇ ئارقىلىق ئاتسېتىلخولىننىڭ بىئولوگىيىلىك ئىشلىتىلىشچانلىقىنى ۋە ئۇنىڭ M3 رېتسېپتورلىرىغا باغلىنىشىنى ئاشۇرىدۇ ھەمدە ئاللوستېرىك تەڭشەش ئارقىلىق ئانگىئوگېن تەسىرىنى كۈچەيتىدۇ.
دەسلەپكى ECلار شىۋىتسارىيە چاشقانلىرىنىڭ ئاورتىسىدىن ئايرىۋېلىندى. ئېلىش ئۇسۇلى كوباياشى كېلىشىمىدىن ئۆزگەرتىلدى 26. چاشقان ECلىرى تۆتىنچى قېتىملىق ئۆتۈشكىچە %5 ئىسسىقلىق بىلەن ئاكتىپسىزلاندۇرۇلغان FBS قوشۇلغان EBM-2 مۇھىتىدا يېتىشتۈرۈلدى.
ئىككى خىل قويۇقلۇقتىكى DEET نىڭ HUVEC، U87MG ياكى BF16F10 نىڭ كۆپىيىشىگە بولغان تەسىرى CyQUANT ھۈجەيرە كۆپىيىش ئانالىزى قورالى (Molecular Probes, C7026) ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى. قىسقىسى، ھەر بىر قۇدۇقتا 5.103 ھۈجەيرە 96 قۇدۇقلۇق تاختايغا ئۇرۇق سېلىنىپ، بىر كېچە چاپلىنىپ، ئاندىن 24 سائەت DEET بىلەن بىر تەرەپ قىلىندى. ئۆسۈش مۇھىتىنى ئېلىۋەتكەندىن كېيىن، مىكرو تاختاينىڭ ھەر بىر قۇدۇقىغا بوياق باغلاش ئېرىتمىسى قوشۇپ، ھۈجەيرىلەرنى 37 سېلسىيە گرادۇستا 30 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىڭ. فلۇئورېسسېنسىيە سەۋىيەسى 485 نانومېتىرلىق قوزغىتىش فىلتىرى ۋە 530 نانومېتىرلىق قويۇپ بېرىش فىلتىرى بىلەن تەمىنلەنگەن Mithras LB940 كۆپ مودېللىق مىكرو تاختاي ئوقۇغۇچ (Berthold Technologies, Bad Wildbad, گېرمانىيە) ئارقىلىق بېكىتىلدى.
HUVEC 96 ئۆڭكۈرلۈك تاختايلارغا ھەر بىر ئۆڭكۈردە 104 ھۈجەيرە زىچلىقىدا ئۇرۇقلاندۇرۇلدى. ھۈجەيرىلەر 24 سائەت DEET بىلەن بىر تەرەپ قىلىندى. ھۈجەيرىلەرنىڭ ياشاشچانلىقى رەڭ ئۆلچەش MTT سىنىقى (Sigma-Aldrich, M5655) ئارقىلىق باھالاندى. ئوپتىكىلىق زىچلىق قىممىتى 570 نانومېتىر دولقۇن ئۇزۇنلۇقىدىكى كۆپ خىل مودېللىق مىكرو تاختا ئوقۇغۇچتا (Mithras LB940) ئېلىندى.
DEET نىڭ تەسىرى سىناق نەيچىسىدىكى ئانگىئوگېنېز سىنىقى ئارقىلىق تەتقىق قىلىندى. 10-8 M ياكى 10-5 M DEET بىلەن داۋالاش HUVEC لاردا كاپىللا ئۇزۇنلۇقىنىڭ شەكىللىنىشىنى ئاشۇردى (رەسىم 1a، b، ئاق بالداقلار). كونترول گۇرۇپپىسى بىلەن سېلىشتۇرغاندا، 10-14 دىن 10-5 M غىچە بولغان DEET قويۇقلۇقى بىلەن داۋالاشتا، كاپىللا ئۇزۇنلۇقىنىڭ 10-8 M DEET دا تۈزلەڭلىككە يەتكەنلىكى كۆرسىتىلدى (قوشۇمچە رەسىم S2). 10-8 M ۋە 10-5 M قويۇقلۇق دائىرىسىدە DEET بىلەن داۋالانغان HUVEC نىڭ سىناق نەيچىسىدىكى ئانگىئوگېنېز تەسىرىدە مۇھىم پەرق بايقالمىغان.
DEET نىڭ يېڭى قان تومۇرلارغا بولغان تەسىرىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن، بىز تىرىك جانلىقلار قان تومۇرلىرىنى كېڭەيتىش تەتقىقاتىنى ئېلىپ باردۇق. 14 كۈندىن كېيىن، 10-8 M ياكى 10-5 M DEET بىلەن ئالدىن يېتىشتۈرۈلگەن ئېندوتېلىي ھۈجەيرىلىرى ئوكۇل قىلىنغان چاشقانلاردا گېموگلوبىن مىقدارى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشقان (1c-رەسىم، ئاق بالداق).
بۇنىڭدىن باشقا، DEET قوزغىغان يېڭى قان تومۇرلار ئۆزگىرىشى U87MG كسېنوگرافت كۆتۈرگەن چاشقانلارغا تەتقىق قىلىندى، بۇ چاشقانلارغا كۈندە (ip) DEET ئوكۇل قىلىندى، بۇ مىقدار 10-5 M پلازما قويۇقلۇقىنى قوزغىتىدۇ، بۇ 23-يىلى كىشىلەرگە نورمال. بايقاشقا بولىدىغان ئۆسمىلەر (يەنى >100 mm3 ئۆسمىلەر) چاشقانلارغا U87MG ھۈجەيرىلىرى ئوكۇل قىلىنغاندىن 14 كۈن كېيىن كۆزىتىلدى. 28-كۈنى، DEET بىلەن داۋالانغان چاشقانلاردا ئۆسمە ئۆسۈشى كونترول چاشقانلىرىغا سېلىشتۇرغاندا كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشتى (1d-رەسىم، كۋادراتلار). ئۇنىڭدىن باشقا، ئۆسمىلەرنىڭ CD31 بوياش نەتىجىسىدە، DEET نىڭ كاپىللا كۆلىمىنى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشۇرغانلىقى، ئەمما مىكرو قان تومۇر زىچلىقىنى ئاشۇرمىغانلىقى كۆرسىتىلدى (1e-g-رەسىم).
مۇسكارىن رېتسېپتورلىرىنىڭ DETA قوزغىغان كۆپىيىشتىكى رولىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن، pFHHSiD (10-7 M، تاللانغان M3 رېتسېپتور ئانتاگونىستى) نىڭ قاتنىشىشىدا 10-8 M ياكى 10-5 M DETA ئىشلىتىلدى. HUVEC بىلەن داۋالاش. pFHHSiD ھەر قانداق قويۇقلۇقتىكى DETA نىڭ كۆپىيىش خۇسۇسىيىتىنى پۈتۈنلەي توسۇپ قويدى (1-جەدۋەل).
بۇ خىل شارائىت ئاستىدا، بىز يەنە DEET نىڭ HUVEC ھۈجەيرىلىرىدىكى كاپىللا ئۇزۇنلۇقىنى ئاشۇرىدىغان-ئۇزراتمايدىغانلىقىنى تەكشۈردۇق. شۇنىڭغا ئوخشاش، pFHHSiD DEET قوزغىغان كاپىللا ئۇزۇنلۇقىنىڭ ئالدىنى زور دەرىجىدە ئالدى (1a، b-رەسىم، كۈلرەڭ بالداقلار). ئۇنىڭدىن باشقا، ئوخشاش سىناقلار M3 siRNA بىلەن ئېلىپ بېرىلدى. كونترول siRNA كاپىللا شەكىللىنىشىنى ئىلگىرى سۈرۈشتە ئۈنۈملۈك بولمىسىمۇ، M3 مۇسكارىن رېتسېپتورىنىڭ جىمجىتلىنىشى DEET نىڭ كاپىللا ئۇزۇنلۇقىنى ئاشۇرۇش ئىقتىدارىنى يوقاتتى (1a، b-رەسىم، قارا بالداقلار).
بۇنىڭدىن باشقا، 10-8 M ياكى 10-5 M DEET كەلتۈرۈپ چىقارغان سىناق نەيچىسىدىكى قان تومۇرلاشتۇرۇش ۋە يېڭى قان تومۇرلاشتۇرۇش pFHHSiD تەرىپىدىن پۈتۈنلەي توسۇلغان (رەسىم 1c، d، چەمبەرلەر). بۇ نەتىجىلەر DEET نىڭ تاللاشچان M3 رېتسېپتور ئانتاگونىستى ياكى M3 siRNA غا سەزگۈر يول ئارقىلىق قان تومۇر ھاسىل قىلىشنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
AChE DEET نىڭ مولېكۇلا نىشانى. AChE نى چەكلەيدىغان دونېپېزىل قاتارلىق دورىلار سىناق نەيچىسىدە ۋە چاشقاننىڭ ئارقا پۇت ئىشېمىيەسى مودېللىرىدا EC قان تومۇرلىرىنىڭ قان ئايلىنىشىنى قوزغىتالايدۇ14. بىز HUVEC دا ئىككى خىل DEET نىڭ AChE ئېنزىم پائالىيىتىگە بولغان تەسىرىنى سىناق قىلدۇق. DEET نىڭ تۆۋەن (10-8 M) ۋە يۇقىرى (10-5 M) قويۇقلۇقى كونترول شارائىتىغا سېلىشتۇرغاندا ئېندوتېلىي AChE پائالىيىتىنى تۆۋەنلىتىۋەتتى (2-رەسىم).
DEET نىڭ ھەر ئىككى قويۇقلۇقى (10-8 M ۋە 10-5 M) HUVEC دىكى ئاتسېتىلخولىنېستېرازا پائالىيىتىنى تۆۋەنلىتىدۇ. BW284c51 (10-5 M) ئاتسېتىلخولىنېستېرازا چەكلىگۈچىلىرىنىڭ كونترول قىلىش ئۇسۇلى سۈپىتىدە ئىشلىتىلدى. نەتىجىلەر ئىككى قويۇقلۇقتىكى DEET بىلەن داۋالانغان HUVEC دىكى AChE پائالىيىتىنىڭ نىسبىتىنى ماشىنا بىلەن داۋالانغان ھۈجەيرىلەرگە سېلىشتۇرغاندا ئىپادىلەيدۇ. قىممەتلەر ئالتە مۇستەقىل سىناقنىڭ ئوتتۇرىچە قىممىتى ± SEM سۈپىتىدە ئىپادىلىنىدۇ. كونترول قىلىش ئۇسۇلىغا سېلىشتۇرغاندا *p < 0.05 (كرۇسكال-ۋاللىس ۋە دانن كۆپ سېلىشتۇرۇش سىنىقى).
ئازوت ئوكسىدى (NO) قان تومۇر ھاسىل قىلىش جەريانىغا 33 قاتنىشىدۇ، شۇڭا DEET قوزغىتىلغان HUVEC لاردا NO ئىشلەپچىقىرىش تەتقىق قىلىندى. DEET بىلەن داۋالانغان ئېندوتېلىي NO ئىشلەپچىقىرىش كونترول ھۈجەيرىلىرىگە سېلىشتۇرغاندا ئاشقان، ئەمما پەقەت 10-8 M مىقدارىدا مۇھىملىققا يەتكەن (3c-رەسىم). DEET قوزغىتىلغان NO ئىشلەپچىقىرىشنى كونترول قىلىدىغان مولېكۇلا ئۆزگىرىشلىرىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن، eNOS نىڭ ئىپادىلىنىشى ۋە ئاكتىپلىشىشى غەربچە بلوتلاش ئۇسۇلى ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى. DEET بىلەن داۋالاش eNOS نىڭ ئىپادىلىنىشىنى ئۆزگەرتمىگەن بولسىمۇ، ئۇ ئاكتىپلىنىش ئورنىدىكى (Ser-1177) eNOS فوسفورلىنىشىنى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشۇرغان، شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ئۇنىڭ تورمۇزلاش ئورنى (Thr-495) نى eNOS فوسفورلىنىشىدىكى داۋالانمىغان ھۈجەيرىلەرگە سېلىشتۇرغاندا ئازايتقان (3d-رەسىم). ئۇنىڭدىن باشقا، ئاكتىپلىنىش ئورنى ۋە تورمۇزلاش ئورنىدىكى فوسفورلانغان eNOS نىڭ نىسبىتى فوسفورلانغان eNOS مىقدارىنى ئېنزىمنىڭ ئومۇمىي مىقدارىغا نورماللاشتۇرغاندىن كېيىن ھېسابلىنىدۇ. بۇ نىسبەت ھەر بىر DEET قويۇقلۇقى بىلەن داۋالانغان HUVEC لاردا داۋالانمىغان ھۈجەيرىلەرگە سېلىشتۇرغاندا كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشقان (3d-رەسىم).
ئاخىرىدا، ئاساسلىق قان تومۇر ھاسىل قىلىش ئامىللىرىنىڭ بىرى بولغان VEGF نىڭ ئىپادىسى غەربىي بلوتلاش ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى. DEET VEGF ئىپادىسىنى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشۇرغان، pFHHSiD بولسا بۇ ئىپادىنى پۈتۈنلەي توسقان.
DEET نىڭ تەسىرى ھەم فارماكولوگىيىلىك توسقۇنلۇققا، ھەم M3 رېتسېپتورلىرىنىڭ تۆۋەنلىشىگە سەزگۈر بولغاچقا، بىز DEET نىڭ كالتسىي سىگنالىنى كۈچەيتىشى مۇمكىن دېگەن پەرەزنى سىناق قىلدۇق. ھەيران قالارلىقى شۇكى، DEET ئىشلىتىلگەن ھەر ئىككى قويۇقلۇقتا HUVEC (سانلىق مەلۇمات كۆرسىتىلمىگەن) ۋە HEK/M3 (رەسىم 4a، b) دىكى سىتوپلازما كالتسىينى ئاشۇرالمىدى.
ئېلان قىلىنغان ۋاقىت: 2024-يىلى 12-ئاينىڭ 30-كۈنى