ئانتىزىمغا قارشى دورا N ، N-diethyl-m-toluamide (DEET) بالىياتقۇ ئىچكى ھۈجەيرىسىدىكى مۇسكۇل M3 قوبۇللىغۇچنىڭ ئاللوستېرلىق ئۆزگىرىشى ئارقىلىق ئانگېگېنىزىمنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.

  
ئانتىزىمغا قارشى دورا N ، N-diethyl-m-toluamide (DEET) AChE (acetylcholinesterase) نى چەكلەيدىغانلىقى ۋە قان تومۇرنىڭ ھەددىدىن زىيادە كۆپ بولۇشى سەۋەبىدىن يوشۇرۇن راك پەيدا قىلىش خۇسۇسىيىتىگە ئىگە ئىكەنلىكى خەۋەر قىلىنغان. بۇ ماقالىدە ، DEET نىڭ ئانگېگېنىزىمنى ئىلگىرى سۈرىدىغان بالىياتقۇ ئىچكى ھۈجەيرىسىنى ئالاھىدە غىدىقلاپ ، ئۆسمىنىڭ ئۆسۈشىنى ئاشۇرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىمىز. DEET كۆپىيىش ، كۆچۈش ۋە يېپىشتۇرۇشنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئانگېگېنىزىمنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان ھۈجەيرە جەريانلىرىنى قوزغىتىدۇ. بۇ ئىچكى ھۈجەيرىلەردە NO ئىشلەپچىقىرىش ۋە VEGF ئىپادىسىنىڭ ئېشىشى بىلەن مۇناسىۋەتلىك. M3 نى جىمىقتۇرۇش ياكى دورىلىق M3 چەكلىگۈچ ئىشلىتىش بۇ ئۈنۈملەرنىڭ ھەممىسىنى ئەمەلدىن قالدۇرۇپ ، DEET كەلتۈرۈپ چىقارغان ئانگېگېننىڭ M3 سەزگۈر ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بالىياتقۇ ئىچكى پەردىسى ۋە HEK ھۈجەيرىسىدىكى كالتسىي سىگنالىغا چېتىشلىق تەجرىبە M3 قوبۇللىغۇچنى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدۇ ، شۇنداقلا باغلاش ۋە ئۇلاش تەتقىقاتى شۇنى ئىسپاتلايدۇكى ، DEET M3 قوبۇللىغۇچنىڭ ئالوستېروللاشتۇرغۇچ رولىنى ئوينايدۇ. ئۇنىڭدىن باشقا ، DEET AChE نى چەكلەيدۇ ، بۇ ئارقىلىق ئاتسېتىلخولىننىڭ بىئولوگىيىلىك ئىقتىدارىنى ۋە ئۇنىڭ M3 قوبۇللىغۇچىسى بىلەن باغلىنىشىنى ئاشۇرىدۇ ۋە ئاللوستېرنى تەڭشەش ئارقىلىق پروگېگېننىڭ تەسىرىنى كۈچەيتىدۇ.
دەسلەپكى EC لار شىۋىتسارىيە چاشقانلىرىنىڭ ئارتېرىيىسىدىن ئايرىۋېتىلدى. ئېلىش ئۇسۇلى كوباياشى كېلىشىمنامىسى 26 دىن ئۆزگەرتىلگەن. Murine ECs تۆتىنچى باسقۇچقىچە EBM-2 ئوتتۇراھاللىقىدا% 5 ئىسسىقلىق قوزغىتىلمىغان FBS تولۇقلانغان.
ئىككى قويۇقلۇقتىكى DEET نىڭ HUVEC ، U87MG ياكى BF16F10 نىڭ كېڭىيىشىگە كۆرسىتىدىغان تەسىرى CyQUANT ھۈجەيرىسىنىڭ كېڭىيىش ئەسۋابى (مولېكۇلا مەسىلىسى ، C7026) ئارقىلىق تەھلىل قىلىنغان. قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، ھەر بىر قۇدۇققا 5.103 ھۈجەيرە 96 قۇدۇق تەخسىگە ئۇرۇق سېلىنىپ ، بىر كېچىدىلا ئۇلاشقا رۇخسەت قىلىنغان ، ئاندىن DEET بىلەن 24 سائەت داۋالىغان. ئۆسۈش ۋاستىسىنى ئېلىۋەتكەندىن كېيىن ، مىكروپولاتنىڭ ھەر بىر قۇدۇقىغا بوياق باغلاش ئېرىتمىسى قوشۇڭ ۋە 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق ھۈجەيرىلەرنى 30 مىنۇت سىڭدۈرۈڭ. فلۇئورېسسېنسىيە سەۋىيىسى Mithras LB940 كۆپ ئىقتىدارلىق مىكرو تىپلىق ئوقۇرمەن (Berthold Technologies ، Bad Wildbad ، گېرمانىيە) ئارقىلىق 485 nm ھاياجانلىنىش سۈزگۈچ ۋە 530 nm بۇلغىما قويۇپ بېرىش سۈزگۈچ ئارقىلىق بېكىتىلدى.
HUVEC ھەر بىر قۇدۇققا 104 ھۈجەيرە زىچلىقىدا 96 قۇدۇق تەخسىگە تېرىلدى. ھۈجەيرىلەر DEET بىلەن 24 سائەت بىر تەرەپ قىلىندى. ھۈجەيرىلەرنىڭ ھاياتىي كۈچى رەڭلىك رەڭلىك MTT تەكشۈرۈشى ئارقىلىق باھالاندى (Sigma-Aldrich, M5655). ئوپتىكىلىق زىچلىق قىممىتى 570 nm دولقۇن ئۇزۇنلۇقىدا كۆپ خىل مىكرو تىپلىق ئوقۇرمەن (Mithras LB940) غا ئېرىشتى.
DEET نىڭ ئۈنۈمى ۋىرۇس ئانگېگېنېز ئانالىزىدا تەتقىق قىلىنغان. 10-8 M ياكى 10-5 M DEET ئارقىلىق داۋالاش HUVECs نىڭ قىل قان تومۇر ئۇزۇنلۇقىنىڭ شەكىللىنىشىنى ئاشۇردى (رەسىم 1a ، b ، ئاق تاياقچە). كونترول گۇرۇپپىسى بىلەن سېلىشتۇرغاندا ، DEET قويۇقلۇقى 10-14 دىن 10-5 M غىچە بولغان داۋالاشتا قىل قان تومۇرنىڭ ئۇزۇنلۇقى 10-8 M DEET ئېگىزلىككە يەتكەنلىكى كۆرسىتىلدى (قوشۇمچە رەسىم S2). 10-8 M ۋە 10-5 M غىچە بولغان DEET بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغان HUVECs نىڭ in vitro proangiogenic ئېففېكتىدا كۆرۈنەرلىك پەرق يوق.
DEET نىڭ نېرۋا قان تومۇرغا كۆرسىتىدىغان تەسىرىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، بىز vivo نېرۋا قان تومۇر تەتقىقاتىدا ئېلىپ باردۇق. 14 كۈندىن كېيىن ، 10-8 M ياكى 10-5 M DEET بىلەن ئالدىنئالا ئىچكى ھۈجەيرىلەرگە ئوكۇل قىلىنغان چاشقانلار گېموگلوبىن مىقدارىنىڭ كۆرۈنەرلىك ئاشقانلىقىنى كۆرسەتتى (1c رەسىم ، ئاق تاياقچە).
ئۇندىن باشقا ، DEET كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان يېڭى قان تومۇر قېتىشىش U87MG xenograft توشۇغۇچى چاشقانلاردا تەتقىق قىلىنغان بولۇپ ، ھەر كۈنى (ip) DEET بىلەن ئوكۇل قىلىنىپ ، پلازما قويۇقلۇقى 10-5 M غا يېتىدىغانلىقى مەلۇم ، بۇ ئاشكارلانغان ئىنسانلاردا نورمال. تەكشۈرگىلى بولىدىغان ئۆسمە (يەنى ئۆسمە> 100 mm3) U87MG ھۈجەيرىسىنى چاشقانغا ئوكۇل قىلىپ 14 كۈندىن كېيىن بايقالغان. 28-كۈنى ، كونترول چاشقانغا سېلىشتۇرغاندا DEET دا ئىشلىتىلگەن چاشقانلاردا ئۆسمىنىڭ ئۆسۈشى كۆرۈنەرلىك يۇقىرى كۆتۈرۈلدى (رەسىم 1d ، كۋادرات). ئۇنىڭدىن باشقا ، CD31 ئۆسمىنىڭ داغلىنىشى DEET نىڭ قىل قان تومۇرنىڭ كۆرۈنەرلىك يۇقىرى كۆتۈرۈلگەنلىكىنى ، ئەمما مىكرو ۋىرۇسنىڭ زىچلىقىنى كۆرسەتمەيدىغانلىقىنى كۆرسەتتى. (رەسىم 1e - g).
مۇسكۇل قوبۇللىغۇچنىڭ DETA كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان كۆپىيىشىدىكى رولىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، 10-8 M ياكى 10-5 M DETA pFHHSiD (10-7 M ، تاللانغان M3 قوبۇل قىلغۇچى قارشى تۇرغۇچى) بار. HUVEC نى داۋالاش. pFHHSiD بارلىق قويۇقلۇقتىكى DETA نىڭ كۆپىيىش خۇسۇسىيىتىنى پۈتۈنلەي توسىدى (1-جەدۋەل).
بۇ شارائىتتا ، بىز يەنە DEET نىڭ HUVEC ھۈجەيرىسىدە قىل قان تومۇر ئۇزۇنلۇقىنى ئاشۇرۇۋېتىدىغان ياكى ئاشۇرمايدىغانلىقىنى تەكشۈردۇق. ئوخشاشلا ، pFHHSiD DEET كەلتۈرۈپ چىقارغان قىل قان تومۇر ئۇزۇنلۇقىنىڭ كۆرۈنەرلىك ئالدىنى ئالدى (رەسىم 1a ، b ، كۈلرەڭ تاياقچە). ئۇنىڭدىن باشقا ، مۇشۇنىڭغا ئوخشاش سىناقلار M3 siRNA بىلەن ئېلىپ بېرىلغان. گەرچە كونترول siRNA قىل قان تومۇرلارنىڭ شەكىللىنىشىنى ئىلگىرى سۈرۈشتە ئۈنۈملۈك بولمىسىمۇ ، M3 مۇسكۇل قوبۇل قىلغۇچى قوبۇل قىلغۇچىنىڭ سۈكۈتتە تۇرۇشى DEET نىڭ قىل قان تومۇرنىڭ ئۇزۇنلىقىنى ئاشۇرۇش ئىقتىدارىنى بىكار قىلدى (رەسىم 1a ، b ، قارا تاياقچە).
ئۇندىن باشقا ، ۋىرۇستا 10-8 M ياكى 10-5 M DEET كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان قان تومۇر ۋە vivo دىكى يېڭى قان تومۇرلار پۈتۈنلەي pFHHSiD تەرىپىدىن توسۇۋېلىندى (رەسىم 1c ، d ، چەمبەر). بۇ نەتىجىلەر DEET نىڭ تاللانغان M3 قوبۇللىغۇچقا قارشى تۇرغۇچى ياكى M3 siRNA غا سەزگۈر يول ئارقىلىق ئانگېگېنىزىمنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
AChE بولسا DEET نىڭ مولېكۇلا نىشانى. AChE چەكلەش رولىنى ئوينايدىغان دونېپېزىل قاتارلىق دورىلار ۋىرۇس ۋە چاشقاننىڭ ئارقا بېزى قان يېتىشمەسلىك ئەندىزىسىدە EC ئانگېگېنىزىمنى قوزغىتالايدۇ. بىز ئىككى قويۇقلۇقتىكى DEET نىڭ HUVEC دىكى AChE ئېنزىم پائالىيىتىگە بولغان تەسىرىنى سىنىدۇق. DEET نىڭ تۆۋەن (10-8 M) ۋە يۇقىرى (10-5 M) قويۇقلۇقى كونترول شارائىتىغا سېلىشتۇرغاندا ئىچكى ئاجراتما AChE پائالىيىتىنى تۆۋەنلىتىدۇ (2-رەسىم).
DEET (10-8 M ۋە 10-5 M) نىڭ ھەر ئىككى قويۇقلۇقى HUVEC دىكى ئاتسېتىلخولىنېستېرېن پائالىيىتىنى ئازايتتى. BW284c51 (10-5 M) ئاتسېتىلخولىنېستېرازا چەكلىگۈچىنى كونترول قىلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن. نەتىجىدە ماشىنا بىر تەرەپ قىلىنغان ھۈجەيرىلەرگە سېلىشتۇرغاندا DEET نىڭ ئىككى قويۇقلۇقى بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغان HUVEC دىكى AChE پائالىيىتىنىڭ نىسبىتى سۈپىتىدە ئىپادىلىنىدۇ. قىممەت ئالتە مۇستەقىل تەجرىبىنىڭ مەنىسى ± SEM دەپ ئىپادىلىنىدۇ. * p <0.05 كونترول قىلىشقا سېلىشتۇرغاندا (Kruskal-Wallis ۋە Dunn كۆپ سېلىشتۇرۇش سىنىقى).
نىترىت ئوكسىد (NO) ئانگېگېنلىق جەريانغا قاتناشقان ، شۇڭا ، DEET غىدىقلانغان HUVECs دا ھېچقانداق ئىشلەپچىقىرىش تەتقىق قىلىنمىغان. DEET دا بىر تەرەپ قىلىنغان بالىياتقۇ ئىچكى ئىشلەپچىقىرىش كونترول ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا كۆپەيتىلگەن ، ئەمما پەقەت 10-8 M مىقدارىدىلا ئەھمىيەتكە يەتكەن (3c رەسىم). DEET كەلتۈرۈپ چىقارغان NO ئىشلەپچىقىرىشنى كونترول قىلىدىغان مولېكۇلا ئۆزگىرىشىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، eNOS ئىپادىلەش ۋە قوزغىتىش غەربنىڭ پارچىلىنىشى ئارقىلىق ئانالىز قىلىندى. گەرچە DEET داۋالاش ئۇسۇلى eNOS ئىپادىسىنى ئۆزگەرتەلمىگەن بولسىمۇ ، ئەمما eNOS فوسفورلىنىشتىكى بىر تەرەپ قىلىنمىغان ھۈجەيرىلەرگە سېلىشتۇرغاندا تورمۇزلىنىش تور بېكىتى (Thr-495) نى ئازايتىش بىلەن بىر ۋاقىتتا ، ئاكتىپلاش ئورنىدا (Ser-1177) eNOS فوسفورلىنىشنى كۆرۈنەرلىك ئاشۇردى (3d رەسىم). ئۇندىن باشقا ، فوسفورلانغان eNOS نىڭ ئاكتىپلاش ئورنى ۋە تورمۇزلاش ئورنىدىكى نىسبىتى فوسفورلانغان eNOS نىڭ ئومۇمىي ئېنزىم بىلەن نورماللاشقاندىن كېيىن ھېسابلىنىدۇ. بۇ نىسبەت بىر تەرەپ قىلىنمىغان ھۈجەيرىلەرگە سېلىشتۇرغاندا DEET نىڭ ھەر بىر قويۇقلۇقى بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغان HUVECs دا كۆرۈنەرلىك ئاشتى (رەسىم 3d).
ئاخىرىدا ، ئاساسلىق ئاقما ئامىللارنىڭ بىرى بولغان VEGF نىڭ ئىپادىسى غەربنىڭ پارچىلىنىشى ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى. DEET VEGF ئىپادىسىنى كۆرۈنەرلىك ئاشۇردى ، ھالبۇكى pFHHSiD بۇ ئىپادىنى پۈتۈنلەي توسىدى.
DEET نىڭ تەسىرى ھەم دورىلىق توسۇلۇش ۋە M3 قوبۇللىغۇچنى كونترول قىلىشقا سەزگۈر بولغاچقا ، DEET نىڭ كالتسىي سىگنالىنى كۈچەيتىشى مۇمكىنلىكىنى پەرەز قىلدۇق. ئادەمنى ھەيران قالدۇرىدىغىنى ، DEET ئىشلىتىلگەن ھەر ئىككى قويۇقلۇقى ئۈچۈن HUVEC (سانلىق مەلۇماتلار كۆرسىتىلمىگەن) ۋە HEK / M3 (4a رەسىم ، b) دىكى سىپوپلازما كالتسىينى ئاشۇرالمىدى.